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免化诊断技术进展

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免疫化学診斷技术的进展 Automated Chemiluminescence System 免疫化学診斷技术 利用抗原抗体反应和分离技术测定 (量)与疾病有关的化学分子。 免疫化学診斷技术的分类 ? 免疫同位素标记測定法 ? 化学发光法 ? 酶联化学发光 ? 偏振荧光 ? 时间分辨荧光 ? 电化学发光 ? 直接化学发光 免疫同位素标记測定法 放射免疫法已有30多年历史。比较其它 传统的方法,它有特异性好,灵敏度 高,准确性好,可靠性强等特点,故 在临床科研上广泛使用。 免疫同位素標記法之局限 ?半衰期短 ; ?試劑批內与批間差异大; ?反應過程長; ?靈敏度有限; ?放射性廢物的處理; 免疫化学发光法 ? 酶联化学发光 ? 偏振荧光 ? 时间分辨荧光 ? 电化学发光 ? 直接化学发光 免疫化学发光法简介 - 酶联化学发光 (EMCLIA) ? 原理: ? 抗体包被的塑料固相 ? 加入待测样本 - 抗原 ? 加入碱性磷酸酶标记的抗体 ?洗 ? 加入底物 - 4-Mup, 发光 ? 产品: ? 雅培Axsym, 梅里埃Vidas, 强生Vitros, ? DPC Immulite 2000, 罗氏ES300 免疫化学发光法简介 - 偏振荧光 (FPIA) ? 原理: ? 標記在小分子抗原上的熒光素經485nm的激發偏振光照射 後,發出光子,經過偏振儀形成525~550nm的偏振光; ? 這一偏振光的強度與熒光素受激發時分子轉動的速度呈反 比,游離的熒光素標記抗原,分子小,轉動速度快,激發 後發射的光子散向四面八方,因此偏振光信號弱; ? 在測定過程中待測抗原小分子,熒光標記抗原小分子和特 導性沆體大分子同時加入到一反應杯中,待測抗原越少, 與抗體競爭結合的量越少,而熒光標記抗原與抗體結合就 越多,而熒光標記的小分子抗原與大分子抗體結合後,其 分子的轉動速度減慢,由此熒光偏振信號強。 ? 产品:雅培Axsym 免疫化学发光法简介 - 时间分辨荧光 (TRFIA) ? 原理: ? 标记物为三價稀土離子如:銪 (Eu3+)、釤(Sm3+)、鏑 (Dy3+)和鋱(Tb3+)等,它們可利用具有雙功能基團結構 的螫合劑,在水溶液中與抗原分子以共軛雙鍵結合,形 成稀土離子—螫合劑—抗原結合物。 ? 當標記稀土離子的抗原與待測抗原共同與抗體競爭結合 ,形成抗原抗體免疫復合物,其中含有標記稀土離子, 然後利用時間分辨熒光分析儀,可測出復合物中稀土離 子發射熒光的強度,以此確定待測抗原的含量。 ? 产品: –EG&G的DELFIA 免疫化学发光法简介 - 电化学发光 (ECLIA) ? 原理: ? 先將特异性抗體包被在磁性微珠。另外將發光劑[Ru (bpy)3]2+標記在特异性抗體上。 ? 將待測樣本與包被抗體的磁性微珠和發光劑標記的抗體 共同溫育,形成磁性微珠包被抗體—抗原—發光劑標記 杭體復合物。 ? 加入TPA緩沖液和TPA在電極表面進行電子轉移,產生電 化學發光。 ? 产品: –罗氏Elecsys 免疫化学发光法简介 - 直接化学发光 (CLIA) ? 原理:利用化學發光技術和磁性微粒子分離技術相結合的 測定方法。以丫啶酯為發光的標記物,固相載體為極細小 的磁性顆粒。其測定原理與放射免疫和聯免中的雙抗體夾 心法和競爭結合法相似。 ? 單克隆抗體或抗原包被磁性微粒 ? 抗原抗體結合,洗滌分離 ? 加入氧化劑發光:經過加入氧化劑(H2O2)和 pH 糾正 液(NaOH)使成鹼性,這時丫啶酯在不需要催化劑的情 況下分解、發光,集光器和光電倍增管接收。記錄5秒 鐘內所產生的光子能。 ? 产品: –拜耳ACS:180SE, Advia Centaur, Advia IMS 免疫化学发光法简介 - 直接化学发光 (CLIA) 全自動化學發光系統 拜耳 ACS (Automated Chemiluminescence System) 直接化學發光的机理 - ACRIDINE ESTER丫啶酯 丫啶酯 :在pH>10时,快速充分释放光子。 ?非常稳定; ?与抗体或抗原结合不 CH Br 影响发光; +N 3 C OO CH 3 CH 3 R ?最 簡 易 ?最 快 速 直接化學發光的机理 丫啶酯 - ACRIDINE ESTER ? 不需催化劑 ? 穩定性高 ? 產光強 ? 線性好 ? 本底低 ? 反應快 ? 結合后不影響發光 ? 靈敏度高 - 可達10-15 摩爾 直接化學發光的机理 丫啶 酯 一 秒 鐘直 接 閃光 , 強 度 是 碘125 在 一 分 鐘 發 出 光 子 的 十 万 倍 1,000,000 光強度 800,000 600,000 400,000 200,000 0 0 直接閃光 慢 發光 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 直接閃光 100 200 300 400 500 600 慢 發光 秒 直接化學發光的机理 RelativeLightIntensity 由 于 超 低 本 底, 直接化學發光具有高靈 敏性 10 9 tracer signal 8 7 6 Fluorescence 5 sensitivity limiBtackground Noise Level of fluorescence 4 3 2 1 sensitivity limit of 0 chemiluminescence 10 -15.5 10 -1710 -1610 -1510 -1410 -1310-12 10 -1110 -1010 -9 10 -8 Chemiluminescence Background Level Tracer Concentration (moles/L) 直接化學發光的机理 RelativeLightIntensity RelativLeIghtIntens



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